Calcio intracelular y función celular.
El ion calcio es un segundo mensajero involucrado en procesos tan diversos como la contracción muscular, la división celular y la muerte por apoptosis, entre otros. Por lo mismo, la regulación de la concentración de calcio intracelular es muy compleja y trascendente. Las células bombean calcio del citoplasma al medio externo para mantener su concentración en el orden de 100 nM en reposo, en contra de 2 mM en el exterior. Diferentes señales externas aumentan el calcio en la célula al abrirse canales permeables al catión, lo cual permite su entrada al citoplasma desde los depósitos intracelulares o desde el medio externo. Existe una gran variedad de canales permeables al calcio modulados por diferentes señales como pueden ser el voltaje, hormonas y neurotransmisores, segundos mensajeros como el IP3 o el propio calcio, entre otros. Dicho aumento de calcio activa receptores intracelulares como la calmodulina, que a su vez activan diferentes efectores como pueden ser otros canales iónicos o complejos de cinasas-fosfatasas y son estos los que desencadena cambios en la conducta celular.
La línea principal del laboratorio es el estudio de los canales permeables a calcio y su participación en la función celular. Esto se lleva a cabo combinando las técnicas de microfluorometría del fura-2 para medir calcio en células individuales, y el patch clamp para registrar la actividad de los canales iónicos.
Son dos los proyectos en desarrollo: la regulación del calcio intracelular en el músculo liso, y la regulación del calcio intracelular durante la apoptosis (muerte celular programada) en células cancerosas.
RESUMEN
En este artículo se aborda el papel del calcio como segundo mensajero y
la red intracelular de señales que provoca. Las señales citosólicas del calcio
se producen cuando aumenta la concentración intracelular de iones de calcio
libres (Ca
2+
), lo que puede ocurrir por la apertura de canales permeables al
Ca
2+
en la membrana celular superficial o en las membranas de los depósitos
intracelulares de Ca
2+
. Las señales del calcio. pueden controlar procesos diferentes, aún en la misma célula. En células pancreáticas, por ejemplo, las se-
ñales de Ca
2+
no sólo controlan la secreción normal de las enzimas digestivas,
sino que también pueden activar la apoptosis celular programada. Avances recientes han demostrado que las señales pueden ser creadas, en el espacio y el
tiempo, mediante otro modelo diferente de señales de Ca
2+
, que obedece a respuestas celulares específicas.
INTRODUCCIÓN
El calcio es un segundo mensajero de los seres vivos, y puesto que es el
único metal que ejerce esa función, ha despertado gran interés en el campo de
la Bioinorgánica y también en el de la Bioquímica, ya que son pocas las rutas
que utilizan estos mensajeros intracelulares —AMPc, GMPc y la del propio calcio—. La ventaja de un ión metálico como el Ca
2+
, frente a las moléculas orgánicas que actúan como segundos mensajeros, como el AMPc o el IP3, es que
no tiene gasto energético, puesto que no es necesaria su biosíntesis, ni una biotransformación.
El calcio se encuentra en el organismo en forma de catión divalente Ca
2+
,
por lo que su radio es mas pequeño que el del Ca atómico, pero al estar hidratado en plasma, el radio de Van der Waals será mayor. La coordinación a moléculas de H2
O es variable, aunque se puede considerar un índice de coordinación de 7-8 como el mas normal. A partir de este complejo, las moléculas de
agua pueden sustituirse por ligandos biológicos y formar parte de proteínas o
dar lugar a compuestos inorgánicos insolubles en el medio orgánico.
Además de su función como segundo mensajero, el calcio tiene su papel a
nivel de las señales de primeros mensajeros, ya que interviene en la liberación
de ellos a través de señales intracelulares de cascadas de quinasas y favorece la
unión neurotransmisor a receptor.
El ión Ca
2+
es el segundo mensajero mas investigado ya que es el que produce mayor número de señales intracelulares, con implicaciones fisiológicas y
patológicas. Las principales de estas, en las células de los mamíferos se muestran en la figura 1.
El calcio es un electrolito del plasma, donde se encuentra en concentraciones de 5 meq/L, frente a 1 meq/L de concentración intracelular, por lo que es
un electrolito extracelular. Por ello, llama la atención que en el desarrollo evolutivo del ser humano, la célula haya elegido a un ión extracelular y no a uno
intracelular, como el Mg
2+
, que pertenece además al mismo grupo de los alcalinotérreos, y con propiedades químicas semejantes. Sin embargo, hay que tener en cuenta que un requisito indispensable para que una sustancia actúe como
segundo mensajero, es la de su unión a proteínas intracelulares específicas muy
especializadas que sean capaces de regular o modular su señal. En el caso de
ANTONIO LUIS DOADRIO VILLAREJO
70los iones metálicos, esto se traduce en su coordinación a la parte proteica del
sitio activo, y por lo tanto a una simetría local precisa y con una termodinámica y cinética muy determinadas. El calcio tiene una coordinación mayor que la
del magnesio, tanto en su hidratación como en su unión a la proteína, ya que de
la primera deriva la segunda por mecanismos de sustitución nucleofílica; así
mientras que el Ca
2+
puede unirse hasta con 8 moléculas de agua, el magnesio
tiene una coordinación menor, de hasta 6, lo que implica menores enlaces en el
sitio activo a los átomos donadores de la proteína y una inferior estabilidad termodinámica que en el caso del calcio, lo que puede ser decisivo para la elección del calcio y no del magnesio como mensajero intracelular. Este hecho, se
ha podido estudiar en la parvalbúmina (1-5), una proteína reguladora de la se-
ñal del calcio, donde se demostró la inestabilidad del magnesio con respecto al
calcio, debido a su menor coordinación (figura 2).
Otros electrolitos, como los aniones fosfatos o cationes como el K
+
son demasiado grandes para entrar en el hueco del sitio activo, mientras que al contrario otros resultan pequeños, por lo que no son adecuados para unirse a los
átomos donadores. El Mg
2+
tiene menor radio iónico (0,65 Å) que el Ca
2+
(0,99
Å), y el complejo que forma es menos estable que el del calcio, al tener que
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LAS REDES DE SEÑALES INTRACELULARES DEL CALCIO
los iones metálicos, esto se traduce en su coordinación a la parte proteica del
sitio activo, y por lo tanto a una simetría local precisa y con una termodinámica y cinética muy determinadas. El calcio tiene una coordinación mayor que la
del magnesio, tanto en su hidratación como en su unión a la proteína, ya que de
la primera deriva la segunda por mecanismos de sustitución nucleofílica; así
mientras que el Ca
2+
puede unirse hasta con 8 moléculas de agua, el magnesio
tiene una coordinación menor, de hasta 6, lo que implica menores enlaces en el
sitio activo a los átomos donadores de la proteína y una inferior estabilidad termodinámica que en el caso del calcio, lo que puede ser decisivo para la elección del calcio y no del magnesio como mensajero intracelular. Este hecho, se
ha podido estudiar en la parvalbúmina (1-5), una proteína reguladora de la se-
ñal del calcio, donde se demostró la inestabilidad del magnesio con respecto al
calcio, debido a su menor coordinación (figura 2).
Otros electrolitos, como los aniones fosfatos o cationes como el K
+
son demasiado grandes para entrar en el hueco del sitio activo, mientras que al contrario otros resultan pequeños, por lo que no son adecuados para unirse a los
átomos donadores. El Mg
2+
tiene menor radio iónico (0,65 Å) que el Ca
2+
(0,99
Å), y el complejo que forma es menos estable que el del calcio, al tener que
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LAS REDES DE SEÑALES INTRACELULARES DEL CALCIO
FIGURA 1. Principales funciones celulares dependientes del calcio. (Tomado de
http://www.ciencia.cl/CienciaAlDia/volumen3/numero2/articulos/articulo1.html).constituir una simetría local con un índice de coordinación inferior, tal como se
muestra en la figura 2, ya que el calcio se une a 7 átomos donadores de oxígeno de grupos carboxílicos —en la parvalbúmina— de un total de 5 ligandos,
quedando una única molécula de agua sin ser sustituida, mientras que el magnesio se une a solo 4 átomos de oxígeno de 4 ligandos y deja 2 moléculas de
agua sin sustituir.
Por ello, la coordinación del calcio en el sitio activo es de 8 y la del magnesio sería de 6, siendo termodinámicamente menos estable, tal como dijimos
anteriormente.
Además de la unión a proteínas específicas, para que una sustancia actúe como
segundo mensajero, es necesario que se modifique su concentración intracelular
ANTONIO LUIS DOADRIO VILLAREJO
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FIGURA 2. Coordinación de Ca
2+
y Mg
2+
a la Parvalbúmin
(6,7). Así, el calcio que está a concentraciones de aproximadamente 0,1 μM, puede incrementarse hasta 1 μM, y todo ello está regulado por un complejo sistema
de canales y bombas de calcio, que vamos a desarrollar a continuación.
CANALES DE CALCIO
La entrada de calcio a las células tiene lugar mediante canales de calcio,
que no necesitan aporte energético, ya que lo hace a favor de gradiente. Estos
canales son de tres tipos:
1. Dependientes del potencial o VOC.
2. Receptor dependientes o ROC.
3. De goteo.
Del primer tipo, se han descrito seis tipos funcionales de canales de calcio
(T, L, N, P, Q y R) y se subdividen en dos categorías: de bajo y de alto umbral
(8). En realidad, el canal de tipo T es el único de bajo umbral descrito, mientras que los canales de tipo L, N, P, Q y R han sido caracterizados como canales de calcio de alto umbral debido a que se requieren grandes despolarizaciones para su activación. Son típicos de células excitables y son de apertura
temporal.
Los canales VOC tienen composiciones complejas y pueden ser lentos o rá-
pidos, lo que se utiliza según el tipo de célula. Así, los canales tipo L son canales lentos (500-1000 begin_of_the_skype_highlighting 500-1000 end_of_the_skype_highlighting mseg), que se activan con un potencial de -10 mV, están compuestos por glicoproteínas y necesitan quinasas AMPc dependientes,
mientras que los de tipo T son rápidos (20-50 mseg); se activan con potenciales de -40 mV y son insensibles al cadmio y antagonistas del calcio. En los canales L se han visto dos formas, una activa y otra inactiva, formada por glicoproteínas α, β y δ, tal como se muestra en la figura 3.
Los segundos, se activan cuando un agonista se une a su receptor específico de membrana, siendo inhibidos por los bloqueantes de los canales de calcio.
Pueden ser canales sensibles a ligandos, que se abren por la unión de un agonista extracelular (generalmente neurotransmisor) y que están presentes en neuronas y músculo liso, y canales activados por agotamiento de las reservas intracelulares, o de entrada capacitativa de calcio, controlados por IP3 en células
no excitables y rianodina en células excitables, y que sirven para recargar los
depósitos intracelulares de Ca
2+
.
73
LAS REDES DE SEÑALES INTRACELULARES DEL CALCIOLa característica común de estos dos tipos, es que necesitan una activación para
abrirse y ser permeables al calcio, bien por potencial eléctrico o por agonista.
Los canales de goteo están siempre abiertos y no necesitan ningún tipo de activación, por lo que son utilizados para mantener la señal del calcio una vez que ha
cesado debido al mecanismo de bombas citosólicas, como veremos mas adelante.
Los canales de calcio son descendientes evolutivos de los de sodio, lo que
puede explicar que algunos bloqueantes de calcio lo sean también del sodio (figura 4). A estos, se les denomina bloqueadores internos, siendo el mas conocido el verapamilo.
ANTONIO LUIS DOADRIO VILLAREJO
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FIGURA 3. Canales L y entrada de calcio.
FIGURA 4. Bloqueadores de los canales de calcio y sodio operados por receptor.BOMBAS DE CALCIO
La regulación de la señal del calcio no sería posible sin un sistema de
bombas e intercambiadores que puedan regular su concentración intracelular. Una vez que el calcio ha aumentado esta, resulta necesario que se restablezca a los niveles normales, para que cese la señal, por lo que el calcio
debe salir al medio extracelular en la misma concentración que entró. Pero
esto no es fácil, ya que al contario de su entrada por canales, la salida del
calcio es en contra de un empinado gradiente de concentración, por lo que
se necesita un aporte energético. Estos sistemas regularán la concentración
de calcio citosólico y su señal como segundo mensajero, pero no son los
únicos. También hay bombas e intercambiadores de calcio para la mitocondria y el retículo, donde tenemos que considerar que la concentración
de calcio es mayor (>10
-3
M en el retículo sarcoplásmico frente a 10
-7
M en
citoplasma), ya que son depósitos de calcio, por lo que en este caso las
bombas e intercambiadores de calcio deben de facilitar la entrada de este
en mitocondria y retículo, mientras que la salida es por canales a favor de
gradiente.
Consecuentemente, vamos a considerar tres tipos de sistemas:
A) Citosólicos
B) Mitocondriales
C) Del retículo sarcoplásmico o endoplásmico.
El calcio que entra por sus canales al citosol, es expulsado de él mediante dos tipos de sistemas citosólicos, una ATPasa dependiente de calcio
(PMCA), que intercambia 1Ca
2+
por 2H
+
y que por ello es eléctricamente
neutra, y otra que intercambia 1Ca
2+
por 3Na
+
que produce un gradiente electroquímico intermenbranal, al tener una carga positiva de mas que libera
energía, que se puede almacenar para utilizarse en otros procesos que son
deficitarios energéticamente. Por tanto, la energía necesaria para este proceso contra gradiente se gasta del ATP o del gradiente electroquímico que
produce energía libre. En la figura 5 se muestra este proceso. El intercambiador Ca
2+
/Na
+
, es de gran capacidad de transporte y baja afinidad para el
calcio (resultando lo contrario la bomba ATPasa) y es especialmente importante en células excitables donde se necesita una salida rápida de calcio del
citosol. En otro tipo de células el protagonismo lo tienen las bombas de calcio ATPasas.
La PCMA forma un complejo enzima fosfato y está codificada por dos familias de genes. Los genes PCMA1 y PCMA4 parecen ser mas genéricos, mientras que los PCMA2 y PCMA3 se expresan de una manera mas restringida.
La entrada de calcio al retículo, tiene lugar mediante una bomba ATPasa
dependiente, denominada SERCA, que intercambia 1Ca
2+
por 1-2H
+
(probablemente solo uno), por lo que puede no ser eléctricamente neutra. Como en la
PCMA, también está codificada, pero en este caso por 3 genes, resultando SERCA1 mas abundante en tejido esquelético, mientras que SERCA2 y SERCA3 lo
son en músculo liso y en tejidos no musculares. En la figura 6 se muestra este
sistema. Estas bombas son ATPasas de tipo P, y se denominan así porque durante su ciclo catalítico el ATP cede su fosfato terminal a un resto de aspártico,
formándose un intermediario fosforilado de la enzima (8). Durante el ciclo de
transporte la enzima pasa por dos estados conformacionales, E1, que está abierto hacia el citosol y es más estable en la forma no fosforilada y E2, que es más
estable en la forma fosforilada y está abierto hacia el compartimento de salida,
tal como se muestra en la figura 7.
La forma E1 de la bomba de calcio de músculo de conejo fue determinada
por difracción de rayos X (9) y contiene dos iones calcio unidos a 3 restos de
glutámico y uno de aspártico, tal como se ve en la figura 8, mientras que la forANTONIO LUIS DOADRIO VILLAREJO
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FIGURA 5. Sistema de bombas de calcio citosólicas.77
LAS REDES DE SEÑALES INTRACELULARES DEL CALCIO
FIGURA 6. Bomba ATPasa del retículo sarcoplásmico.
FIGURA 7. Mecanismo de la bomba de calcio del retículo sarcoplásmico ATPasa.
(Tomado de ref. 8).ANTONIO LUIS DOADRIO VILLAREJO
78
FIGURA 8. Forma E1 de la SERCA ATP asa del músculo de conejo. (Tomado de:
http://webpages.ull.es/users/bioquibi/temascompletos/transporte).
FIGURA 9. Estructura E2 de la SERCA ATPasa del músculo de conejo. (Tomado de:
http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1KJU).ma E2 fue descrita por Xu, Stokes y col. (10, 11), y se muestra en la figura 9.
La bomba ATPasa del citosol también pertenece a este tipo de familia de bombas, Ca
2+
ATP asa dependientes, pero es menos conocida.
La mitocondria parece que no tiene un sistema de bombas ATPasas similar
a las dos anteriores, y es en realidad un mero neutralizador de cargas, entrando
1Ca
2+
acompañado de una molécula de H2
PO4
-
a nivel de la membrana interna,
por lo que no es eléctricamente neutro y tiene que utilizar posiblemente el gradiente electromembranal almacenado en otros procesos donde se crea energía.
De esta forma, en el interior de la mitocondria se almacena calcio en forma de
hidroxiapatito (Ca
10
(PO4
)6
(OH)2
) muy insoluble, que se tiene como reserva de
calcio para ser utilizado en caso de déficit intracelular de aquél. La salida de
calcio a favor de gradiente desde la mitocondria al citosol, está operado a nivel
de la membrana interna por un intercambiador calcio-sodio, que es eléctricamente neutro (1Ca
2+
/2Na
+
) y que por tanto no libera energía, tal como podemos
ver en la figura 10. También es posible el intercambio con 1H
+
.
Las bombas de calcio son activadas por calmodulina, IP3, fosforilación de
quinasas o escisión proteolítica del ATP.
Un tipo de bomba de calcio poco conocida es la denominada de «goteo».
Esta bomba está asociada a un canal de calcio, que permanece siempre abierto
79
LAS REDES DE SEÑALES INTRACELULARES DEL CALCIO
FIGURA 10. Intercambio de calcio a nivel mitocondrial.y que proporciona un continuo flujo de iones de calcio citosólicos, pero a nivel
submembranal, tal como se muestra en la figura 11. La bomba está regulada por
el DAG (diacilglicerol) y el PKC (proteína quinasa) y su papel parece fundamental para poder interpretar las señales intracelulares del calcio, como veremos mas adelante.
LA RUTA INTRACELULAR DEL CALCIO
Se puede considerar que la ruta de señales intracelulares del calcio es la de
mayor importancia, ya que genera nuevos mensajeros intracelulares e interviene en la biosíntesis del AMPc a partir del ATP. Esta ruta, junto con la del AMPc,
a la que va asociada en la cascada de quinasas que originan numerosas funciones a nivel intracelular se muestran en la figura 12.
Todo segundo mensajero necesita la activación de un primer mensajero, que
envía su señal a través de un transductor de señales biológicas intermembranales, compuesto por proteínas G y que son capaces de modular esta, para a su
vez transmitirla a un amplificador de señal, que en el caso del calcio es la fosfolipasa C y en la ruta del AMPc, la adelinato ciclasa. En estas rutas, se fabrican los segundos mensajeros AMPc, IP3 (1,4,5 trifosfato inositol) y DAG (diacilglicerol) —ver figura 12— pero no el calcio ya que como hemos dicho no se
biosintetiza. En la ruta del calcio, por tanto, se puede disponer de tres mensajeros, el propio calcio, el IP3 y el DAG.
Estructura intracelulares que regulan el calcio citosólico
El ion calcio es un mensajero intracelular utilizado por numerosas hormonas y neurotransmisores para activar múltiples funciones celulares, desde la contracción o la secreción hasta la expresión de genes. Sus implicaciones fisiológicas son por tanto diversas, desde su papel en tejidos secretores o el músculo hasta la transmisión sináptica. El desarrollo de este campo se ha acelerado mucho durante la década de los ochenta y noventa, con la caracterización de los sistemas de transporte de calcio que dan forma a las señales producidas por hormonas y neurotransmisores. Actualmente es evidente que las señales de calcio son un código heterogéneo que se adapta a las funciones de cada tipo celular. Este código puede considerarse como un idioma o lenguaje celular, cuyos componentes comienzan ahora a desvelarse.
De perros, mensajes y palomas
Una tarde de principios de siglo unos fisiólogos británicos realizaban un experimento: al instilar ácido en el duodeno de un perro el páncreas secretaba un copioso volumen de jugo pancreático (Bayliss y Starling, 1902). Como la secreción pancreática también aumentaba al inyectar intravenosamente un extracto de intestino delgado o sangre de otro perro en periodo de digestión, era obvio que el quimo procedente del estómago liberaba desde el intestino hacia la circulación general "algo" que ordenaba al páncreas hacer su trabajo (verter en el duodeno una secreción rica en enzimas digestivas y bicarbonato). Había nacido el concepto de "hormona" (literalmente "poner en movimiento"), aunque ese nombre no se utilizó hasta un corto tiempo después.
Comprender por qué el páncreas hace su trabajo cuándo y cómo debe hacerlo es algo que, además de ser una tarea inacabada que ha ocupado a fisiólogos y otros investigadores durante buena parte de este siglo, atañe al objetivo último de la biología en general y de la fisiología en particular: ¿cómo funcionan nuestros órganos y células? y más concretamente ¿cómo se regula la función de un tejido ante una situación concreta? Aunque la respuesta a esta pregunta es demasiado compleja para este contexto, una parte de ella nos sirve para iniciar la historia del principal protagonista de nuestra historia: el ion calcio o Ca2+.
Pero ¿por qué este ion ha sido objeto de estudio durante décadas? Recordemos que nuestro organismo está formado por millones de células entre las cuales debe establecerse comunicación. Los mensajeros encargados de esta comunicación son las hormonas, moléculas liberadas por ciertos tejidos, y los neurotransmisores, liberados por los nervios en la inmediación de otras células. Si seguimos con nuestra historia inicial, cuando el quimo gástrico va pasando al duodeno, las proteínas y el ácido que contiene hacen que la mucosa intestinal libere en la circulación varias hormonas que, al llegar a las células del páncreas, se unen a su receptor (una proteína incrustada en la membrana plasmática de la célula). Ahora, estos mensajeros intercelulares (primeros mensajeros) deben usar un "lenguaje" o mensajero intracelular (segundo mensajero) que sea entendido por las estructuras de la célula de las que el organismo espera obtener una repuesta, en nuestro caso la secreción de jugo pancreático. Pues bien, el ion Ca2+ es el sistema de señales intracelulares aparentemente más ubicuo, más investigado y conocido y con mayor número de implicaciones fisiológicas y patológicas entre todos los conocidos.
Figura 1. Algunas de las funciones celulares dependientes del ion calcio en las células de mamíferos.
La importancia del calcio en algunas funciones celulares ya había sido descubierta por Ringer a fines del siglo pasado, cuando observó que el músculo cardiaco no se contraía adecuadamente si se encontraba en una solución fisiológica preparada con agua destilada en vez de agua del grifo (Ringer, 1883). El motivo era que el Ca2+ del agua de grifo era necesaria para la contracción. Posteriormente se hizo evidente que esta misma dependencia se daba en otros tejidos: en los años sesenta se concluyó que en la secreción de adrenalina por la médula adrenal participaba el Ca2+ extracelular (Douglas & Rubin, 1961), lo que dio lugar al concepto de acoplamiento estímulo-secreción, similar al existente previamente de excitación-contracción para el músculo, según el cual la respuesta celular era mediada por el ion Ca2+. También el sistema nervioso resultó depender del calcio para la liberación de los neurotransmisores, que son las señales existentes entre dos neuronas o entre neuronas y otros tejidos (Katz, 1969). Como además numerosas hormonas aumentaban la concentración de Ca2+ en el citosol ([Ca2+]i) de sus células diana, la conclusión era obvia: el calcio es un mensajero intracelular utilizado por determinados mensajeros extracelulares, como por ejemplo la hormona CCK, liberada desde la mucosa intestinal durante la digestión. Actualmente sabemos que las señales de Ca2+ o cambios de [Ca2+]i son responsables de funciones tan distintas como la secreción, la contracción muscular, la comunicación entre neuronas, la muerte celular, etc. Pero lo que discutiremos es ¿cómo se generan y regulan estas señales de Ca2+? Estas preguntas permanecieron sin respuesta durante bastante tiempo, y hoy sólo sabemos contestarlas parcialmente.
Para esbozar una respuesta volveremos al tejido pancreático con el que iniciábamos nuestra historia. Ahora estamos en los años 50. Los Hokin, un matrimonio de investigadores norteamericanos en una estancia en Inglaterra, intentan reproducir observaciones de un científico ruso. Al incubar fragmentos de páncreas de palomas con CCK o con el neurotransmisor acetilcolina (o ACh) (otro estimulante del páncreas), la composición lipídica de las membranas de las células cambiaba rápidamente (Hokin y Hokin, 1955). Posteriormente observaron que este efecto también ocurría en cerebro y que el cambio de composición consistía en que los estimulantes descomponían a gran velocidad un tipo de lípidos de membrana llamado fosfolípidos de inositol, más exactamente el fosfatidil inositol 4,5 bifosfato (PI(4,5)P2). Aunque durante años intentaron descubrir el significado de este proceso hubo que esperar a que en 1975 Mitchell, un investigador británico, basándose en resultados previos de numerosos autores, formulase una hipótesis que relacionaba la hidrólisis de los lípidos de inositol con las señales de Ca2+: los neurotransmisores y hormonas que movilizan el Ca2+ lo hacen hidrolizando los lípidos de inositol, y un producto de esta hidrólisis es el factor que hace que el calcio intracelular aumente en la célula (Michell, 1975). Sólo en 1983 fue posible, utilizando nuevamente como modelo el páncreas exocrino, identificar el producto que iniciaba la señal de calcio, y resultó ser una pequeña molécula llamada 1,4,5 trisfosfato de inositol o IP3, como descubrió Michael Berridge en colaboración con el laboratorio de Irene Schulz, de Alemania (Streb y cols., 1983). Como podemos ver, en este campo hay contribuciones claves de numerosos investigadores, lo que quizás sea una explicación (¿o excusa?) de por qué ninguno de ellos ha recibido el premio Nobel, algo que sí han conseguido algunos de los descubridores de otros mensajeros intracelulares como el adenosin monofosfato cíclico (AMPc) o el óxido nítrico (NO) —aunque relegando a Salvador Moncada-. Pero esa sería otra historia.
El lenguaje del Ca2+
Las señales de calcio que muchos mensajeros intercelulares producen en las células pueden considerarse como un código o lenguaje que produce en los tejidos la respuesta deseada. A descifrar esto han contribuido excepcionalmente marcadores ópticos fluorescentes (quimioluminiscentes en algunos casos) que, introducidos fácilmente en las células, emiten más o menos luz en función de la [Ca2+]i. El más utilizado ha sido el fura-2, desarrollado por el estadounidense Roger Tsien a mediados de los 80, y esencial en el desarrollo de este campo.
Básicamente, los métodos de medida iniciales (isótopos radiactivos del Ca2+, electrodos de Ca2+, marcadores ópticos en poblaciones celulares enteras) nos enseñaron que un primer mensajero aumenta la [Ca2+]i de manera transitoria, con un pico o elevación inicial seguida de un descenso posterior hasta un nivel final variable según el estímulo y el tejido (véase la figura 2A). Ese aumento sería una de las señales intracelulares que conducen a la secreción, la contracción, etc. A mayor nivel de estimulación y de [Ca2+]i, mayor respuesta celular. Pero a principios de los 90 la aplicación del microscopio permitió medir la [Ca2+]i en tiempo real en células individuales (y no en suspensiones de hasta millones de células, como ocurría antes), y trajo una sorpresa: Cobbold y Cuthbertson, de la Universidad de Liverpool, observaron que al estimular hepatocitos la [Ca2+]i aumentaba de manera cíclica, formando lo que hoy llamamos oscilaciones de calcio (Woods y cols., 1986) (Figura 2B).
Figura 2. Algunos tipos de señales de calcio. A y B Las gráficas representan aumentos en la concentración de calcio citosólico en células acinares de páncreas cargadas con el indicador Fura-2 (la fluorescencia del Fura-2 es índice de la concentración de calcio). Puede observarse tanto una respuesta transitoria a una concentración máxima de la hormona CCK (10 nM) como oscilaciones en respuesta a concentraciones postprandiales (10 pM). C contiene una secuencia de imágenes de fluorescencia de células acinares durante la estimulación inicial con ACh. En cada imagen el color rojo representa mayor concentración de calcio, y los colores azules menor concentración. El gráfico muestra la concentración de Ca2+ en los polos secretor (luminal) y basal. El primero es la zona granulosa de la fotografía de la izquierda. Obsérvese que el polo luminal responde antes que el basal.
Este hallazgo modificó sustancialmente la visión que se tenía de las señales de calcio. Previamente, se pensaba que una vez que el calcio aumentaba en una célula, su acción se extendía por toda ella de una manera gradual y paulatina. Pero esa señal, de tipo analógico, no es demasiado eficiente si la comparamos con señales de tipo "digital". Y eso es lo que parecen ser las oscilaciones. Una oscilación tiene dos parámetros básicos, la amplitud y la frecuencia. Cuando una célula necesita activar un proceso determinado puede simplemente aumentar uno de estos parámetros (como las ondas de radio), con lo que evita un efecto indeseable del calcio, su toxicidad. Además, cambios en la frecuencia y la amplitud permiten mayor riqueza de "palabras" que un simple cambio gradual de [Ca2+]i, con lo que se pueden dirigir mensajes específicos a proteínas u orgánulos sin que se activen otros innecesariamente, ya que cada uno podría ser activado por un patrón diferente de ciclos. Recientemente se ha demostrado que incluso la expresión génica es regulada mediante estas oscilaciones (Li y cols., 1998). Más aún, un elegante estudio en células pancreáticas acinares ha demostrado por vez primera de manera directa que con cada oscilación de Ca2+ tienen lugar cambios simultáneos en la concentración de la proteína calmodulina, uno de los puntos de acción más ubicuos e importantes para el ion calcio a la hora de activar funciones celulares (Craske y cols., 1999). La implicación de este hallazgo es que las oscilaciones de Ca2+ realmente tienen una consecuencia directa e inmediata sobre los procesos bioquímicos que son la base de las funciones celulares.
Otra ventaja de las oscilaciones es que energéticamente serían menos costosas de controlar que una señal analógica, porque la célula no tendría que esforzarse continuamente en bombear el calcio fuera del citosol (como veremos más adelante), sino tan sólo durante el momento en que se produjera cada ciclo de calcio. Y por último, en una señal oscilatoria es mucho más fácil distinguir lo que es una señal (una oscilación) del ruido de fondo que en el caso de una señal basada en el valor absoluto de la [Ca2+]i.
El uso del microscopio también ha conducido a otro descubrimiento sorprendente: con frecuencia las señales de calcio se expanden por el citosol a partir de una zona concreta de la célula, como una onda u ola de Ca2+ (Gilkey y cols., 1978). Uno de los primeros tejidos en los que se observó la presencia de olas de calcio fueron las células del páncreas exocrino (Kasai & Augustine, 1990) (Figura 2C). Estas células están polarizadas, con los gránulos secretores (zimógeno) ocupando completamente el polo luminal o apical, mientras el retículo endoplasmático se expande por casi la totalidad de la zona basolateral de la célula. Cuando la ACh o la CCK estimulan estas células el primer sitio en que aumenta el [Ca2+]i es el polo apical. Incluso, y más sugerente desde el punto de vista fisiológico, para grados de estimulación considerados fisiológicos (concentraciones de CCK similares a las que hay en la sangre durante la digestión), este polo puede desarrollar oscilaciones locales que, restringidas a esa zona, no se expanden al resto de la célula (Thorn y cols., 1993).
Desde el punto de vista de la fisiología celular la aparición de señales subcelulares, restringidas a una zona de la célula, es una gran ventaja, ya que permite que solamente se active esa zona. Pensemos, por ejemplo, en las neuronas o en las células acinares. Las primeras solamente necesitan, de manera rutinaria, que el calcio aumente en los terminales sinápticos para poder liberar neurotransmisor. En el caso del páncreas, para activar la exocitosis y secreción de las enzimas digestivas es suficiente que se formen señales dentro de la zona apical, donde tiene lugar la exocitosis. Más adelante veremos cómo se organizan los elementos de la señal de Ca2+ para hacer posible esa compartimentalización de la señal de calcio.
El alfabeto del calcio
La figura 3 muestra un esquema simplificado de lo que sabemos hoy acerca de cómo las hormonas incrementan la concentración citosólica de Ca2+, que en una célula cualquiera es unas 10.000 veces menor que la concentración en el plasma y demás líquidos extracelulares. En el interior de los orgánulos intracelulares, como el retículo endoplasmático (cisternas subcelulares que, entre otras funciones, sintetizan las proteínas de una célula), la concentración de Ca2+ libre es también elevada, entre cientos y quizás miles de veces la del citosol. Por tanto, si se desea que aumente la [Ca2+]i, lo más sencillo es simplemente abrir un canal (una molécula que actúa como una puerta proteica) para que el Ca2+ confinado en esos verdaderos depósitos intracelulares y en el exterior de las células entre en el citosol a gran velocidad. Y esto es lo que hacen las células. Tomando como ejemplo las células acinares del páncreas, la unión de la CCK a su receptor de membrana hidroliza PI(4,5)P2 gracias a proteínas intermedias denominadas proteínas G. El resultado es que se genera una gran cantidad de IP3, molécula de pequeño tamaño que difunde a gran velocidad por el citosol y se une a un canal de los depósitos internos de Ca2+ denominado receptor del IP3 o IP3R. Como consecuencia, el canal se abre y permite la salida de iones calcio desde los depósitos, lo que conduce al aumento de [Ca2+]i.
Figura 3. Principales mecanismos de control de la concentración de Ca2+ citosólico. Los mensajeros extracelulares producen señales liberando calcio desde los depósitos intracelulares mediante IP3 o abriendo canales de calcio de la membrana plasmática, bien por despolarización (caso de las neuronas) bien por interacción directa con el canal (como glutamato en algunas sinapsis). En cualquier caso, el vaciamiento de los depósitos (retículo endoplasmático, y probablemente gránulos secretores) abre, mediante un mecanismo desconocido (X?), un tipo de canales de calcio diferentes (entrada capacitativa de calcio). Para mantener controlada la concentración de calcio y evitar incrementos excesivos, las células retiran el calcio del citosol mediante bombas o intercambiadores de la membrana plasmática (PMCA, Na/Ca) o mediante bombas de los depósitos (SERCA). El rellenado de los depósitos requiere la presencia de protones (H+) en su interior. Otros orgánulos como las mitocondrias también pueden captar calcio.
Una pregunta importante es ¿cuál es la identidad del depósito de Ca2+? Todas las evidencias indican que se trata del retículo endoplasmático, aunque hace muy poco algunos estudios han señalado que probablemente en él existan subcompartimentos. Esto último es todavía un misterio, sobre todo porque los datos experimentales indican que, desde el punto de vista funcional hay más de un depósito, como si el retículo tuviese compartimentos, aunque morfológicamente esto no es así. Sencillamente, aunque ha habido algunos avances recientes (Alvarez y cols., 1999) no disponemos de la tecnología necesaria para observar el interior de los depósitos con la suficiente resolución como para contestar esta pregunta.
Además del retículo podrían tener importancia como depósitos otros dos orgánulos: los gránulos de secreción y las mitocondrias. Durante mucho tiempo los primeros han sido considerados como un punto con gran cantidad de calcio pero no movilizable por los estimulantes celulares. Sin embargo, algunos resultados muy recientes, y todavía controvertidos, indican que el IP3 puede liberar calcio desde su interior, como se ha demostrado directamente en gránulos aislados de zimógeno del páncreas (Mogami y cols., 1997). Esto coincidiría plenamente con la localización del punto de inicio de las señales en estas células. En cuanto a las mitocondrias, es ya sabido hace tiempo que pueden acumular calcio cuando la [Ca2+]i llega o supera 1 µM (frente al 0.1 µM en reposo). Pero gracias al desarrollo de la microscopía confocal (microscopía de luz de alta resolución en profundidad) y marcadores fluorescentes que se localizan exclusivamente en las mitocondrias, se ha podido detectar que realmente pueden actuar como un sistema de captación del Ca2+ citosólico de una manera continua, modulando las señales producidas por hormonas y neurotransmisores al actuar como un tampón de Ca2+.
Otro aspecto que es hoy tema de intenso estudio son los aspectos "subcelulares" de las señales de calcio. En efecto, cuando la microscopía revolucionó el estudio del Ca2+ no solamente descubrió la presencia de oscilaciones y olas de Ca2+. Como ya señalamos antes, se encontró que podían producirse señales de Ca2+restringidas a zonas pequeñas de la célula. En el músculo se han denominado sparks ("chispas") y parecen tener importancia en el desarrollo de la contracción.
Desde un punto de vista fisiológico, toda esta heterogeneidad de señales se organiza de una manera precisa y controlada en la función celular. Pensemos de nuevo en las pequeñas células acinares pancreáticas. Tienen un polo repleto de gránulos de zimógeno que han de verter hacia los conductos pancreáticos cuando la ACh y la CCK liberadas durante la digestión activen en ellas señales de Ca2+, algo que puede durar al menos decenas de minutos. Pero, para no activar innecesariamente múltiples procesos (algunos indeseables), las células circunscriben esas señales al polo apical utilizando varias estrategias. Primero, liberan el Ca2+ inicialmente desde los depósitos de esa zona, donde es más necesaria su presencia puesto que es ahí donde ocurre la exocitosis. Y eso ocurre en presencia de muy baja estimulación, como es probable que ocurra durante la fase cefálica de la digestión, cuando el olor o la visión de la comida (o incluso su mera evocación) activa las fibras de un nervio denominado vago que libera en nuestro páncreas ACh. Segundo, adoptan estrategias que tienden a restringir la señal. Recientemente hemos descrito que las células acinares tienen una altísima capacidad de unir o tamponar el Ca2+ citosólico (varios órdenes magnitud más que otras células) (Mogami y cols., 1999), lo que evita la difusión.. A esto ayuda la gran capacidad de reacumulación de calcio que tienen los depósitos (Camello y cols, 1996) y la acumulación en las mitocondrias (Tinnel y cols, 1999). Además, expulsan con gran velocidad el calcio por el polo apical, donde se inicia la señal, lo que también ayuda a evitar su difusión (Belan y cols, 1997). Estas señales de Ca2+ causan la exocitosis de los gránulos más cercanos a la membrana, y posiblemente "preparan" a otros para que luego, cuando la CCK es liberada al llegar el alimento al duodeno, se generen oscilaciones de [Ca2+]i que estimulan la secreción más intensamente. Para activar en el retículo, núcleo y otros puntos, la formación de nuevos gránulos de secreción que reponen las proteínas secretadas una parte de las oscilaciones se expande como una ola al resto de la anatomía celular.
Este aspecto de la restricción subcelular de la señal de Ca2+ es especialmente importante, ya que un exceso de calcio tiene consecuencias tóxicas en nuestras células, como la necrosis y la apoptosis, además de alterar la fisiología de algunos orgánulos intracelulares. Este aspecto es especialmente crucial en células de pequeño tamaño si pretenden ser capaces de desarrollar aumentos de calcio restringidos a un área pequeña. Sin embargo, hasta ahora hemos olvidado cómo el calcio extracelular interviene en las señales, y de hecho interviene si recordamos que su presencia es necesaria para muchas respuestas. Cuando se pudo determinar la [Ca2+]i, se observó que, aunque la señal de Ca2+ puede iniciarse sin Ca2+ extracelular, a corto o medio plazo desaparece sin él. Además, en algunos tejidos esto ocurre muy rápidamente (por ejemplo, en la médula adrenal). Esto se debe a que las hormonas, tras liberar el Ca2+ de los depósitos, activan la entrada de Ca2+ extracelular, que entra a gran velocidad por la membrana debido a que está muy concentrado en el exterior. Este calcio de origen externo sirve para dos propósitos: recargar los depósitos y mantener la señal de [Ca2+]i producida por la hormona.
En algunos tejidos la entrada de calcio extracelular es relativamente sencilla. En células excitables que funcionan desarrollando pequeñas señales eléctricas, como neuronas y muchas células musculares lisas (presentes en vasos sanguíneos, iris, uretra, intestino y otras vísceras) el Ca2+ puede entrar simplemente porque cuando estas señales se expanden por la membrana abren canales para el Ca2+, que entra en la célula para activar determinados procesos (Figura 3). Esto es patente, por ejemplo, en las sinapsis, donde el calcio necesario para la liberación del neurotransmisor entra al abrirse en la membrana plasmática canales de calcio activados por voltaje en respuesta al cambio en la polaridad eléctrica de la membrana que ocurre al llegar a ese punto una señal nerviosa (potencial de acción).
Sin embargo, en los tejidos no excitables el modo en que las células activan la entrada de calcio extracelular sigue un sistema diferente, que además está presente también en las células excitables. Estudios en los años 80 pusieron de manifiesto que la entrada se activaba cuando los depósitos intracelulares se iban vaciando. En 1986 J.W. Putney acuñó el término entrada capacitativa de calcio (ECC) para designar un modelo según el cual el grado de vaciado/llenado de los depósitos regularía la apertura/cierre de los canales de la membrana (Figura 3). Este modelo parece ser correcto en opinión de la inmensa mayoría de los especialistas del campo pero, cómo los depósitos controlan los canales de entrada es actualmente un tema de intenso debate. Básicamente existen dos teorías o grupos de teorías: los depósitos se encuentran lo suficientemente cerca de la membrana plasmática como para que los estimulantes activen la entrada de calcio mediante una interacción molecular directa, resultado del vaciamiento. La otra teoría es que al reducirse el contenido de calcio de los depósitos se genera una señal o mensajero químico que abriría los canales. La identidad de este mensajero es también objeto de polémica: NO y guanosin monofosfato cíclico (GMPc), enzimas que fosforilan proteínas en residuos tirosina, un producto de la enzima citocromo P 450, un misterioso factor de "influx" de calcio, etc., son los principales candidatos. Sin embargo, hasta el momento todo es hipótesis. Datos apoyan y contradicen ambas hipótesis, por lo que todavía no disponemos de explicación para uno de los aspectos más importantes de la fisiología del calcio, que además tiene evidentes implicaciones fisiopatológicas.
En otro aspecto, es también misterioso el canal de entrada capacitativa: mientras que los canales de Ca2+ operados por voltaje en neuronas, músculo liso y algunas glándulas endocrinas son relativamente bien conocidos, el canal capacitativo es casi absolutamente desconocido. Sólo hace unos pocos años se ha podido comenzar a medir algunas de sus características, si bien de modo muy incompleto, pues su tamaño reducido lo sitúa más allá del límite de detección de los métodos de registro actuales. La corriente de entrada a través de este canal se denomina ICRAC (por calcium release activated current), y fue descubierta por dos fisiólogos alemanes (Hoth & Penner, 1992). Sin embargo, algunas características, como la selectividad para el calcio frente a otros cationes divalentes como el Zn2+ o el Mn2+ o frente al Na+, no parecen coincidir con lo que sabíamos acerca de la entrada capacitativa. Recientemente hemos encontrado en células de páncreas que tras la activación con ACh las características de selectividad de la entrada de calcio desde el exterior, y su dependencia de ciertas señales intracelulares, van cambiando a lo largo del tiempo, en consonancia con la descripción por otros autores de la coexistencia de más de una vía de entrada capacitativa en otros tejidos (Camello y cols., 1999). Lo más interesante es que se han encontrado en mamíferos, incluyendo el ser humano, genes que codifican un tipo de canales complejos para el calcio que presentan algunas características que podrían coincidir con nuestra descripción y la de otros autores. El producto de estos genes, como en invertebrados, son una proteína llamada TRP y otra llamada TRP-l, que son candidatos a actuar como canal capacitativo, si bien nadie lo ha demostrado todavía (Montell, 1997). Es de resaltar el hecho de que algunas proteínas que interaccionan con estos canales parecen ser capaces de formar GMPc, que es uno de los candidatos a activar la entrada del calcio. Es probable que el "misterio" de la entrada capacitativa se resuelva, como ocurrió con el ciclo de los lípidos de inositol, gracias al esfuerzo de un autor o un grupo que se dedique simplemente a montar el intrincado rompecabezas que son los miles de artículos publicados sobre el tema, como también fue el caso de la doble hélice de ADN. Aunque el círculo parece cerrarse, el influjo capacitativo sigue siendo todavía una presa muy escurridiza para la industria de la investigación. Y dado que la entrada de calcio puede estar implicada en muchos procesos patológicos (hipertensión, inflamaciones como la pancreatitis, muerte celular, etc.) es de vital importancia resolver este problema.
Junto a los sistemas que permiten la entrada de calcio al citosol, ya sea desde el exterior celular o desde el interior de los depósitos, las células disponen de sistemas para retirar este ion del citosol, algo crucial dada su posible toxicidad. Uno de ellos consiste en expulsarlo hacia el líquido extracelular. Eso lo llevan a cabo dos sistemas: una bomba de la membrana plasmática denominada Ca2+ ATPasa de la membrana plasmática, y un intercambiador Na+/Ca2+ (que aprovecha la energía cedida por iones Na+ al entrar en el citosol -a favor de su gradiente electroquímico-). Ambos sistemas operan de manera continua, incluso expulsan calcio con cada oscilación de calcio (Tepikin y cols., 1992). Sin embargo, es más poderoso otro sistema que transporta, mediante la bomba denominada Ca2+ ATPasa del retículo endoplasmático, iones calcio al interior de los depósitos. Esto no sólo reduce la [Ca2+]i, sino que sirve para rellenar los depósitos, algo crucial para mantener la capacidad de respuesta celular en la mayor parte de los tejidos. Nosotros hemos encontrado que tanto la recarga de los depósitos como el transporte al medio extracelular son procesos muy intensos en el caso de las células del páncreas, sobre todo la recarga (Camello y cols., 1996), y están modulados por la [Ca2+]i, de modo que cuando supera los niveles basales su actividad aumenta de manera espectacular.
Un aspecto poco conocido del proceso de recarga de los depósitos es el papel jugado por el pH (acidez), que ha sido investigado básicamente en células salivares y pancreáticas. Ya hace algún tiempo se lanzó la hipótesis de que la recarga depende de que existan gradientes de pH en el interior de los depósitos, de modo que el calcio y los protones se intercambian (Schulz y cols., 1989) (Figura 3). Recientemente, hemos obtenido resultados que indican por primera vez en células intactas que en los depósitos de Ca2+ existen bombas de protones que crean en su interior unas condiciones de acidez necesarias para la recarga y para redistribuir el calcio entre los depósitos a partir de los puntos de entrada (Camello y cols, 2000). Esto explicaría por qué hemos encontrado, al igual que otros investigadores, una fuerte interrelación entre el pH de una célula y la [Ca2+]i, y que los gradientes subcelulares de pH sean necesarios para que las señales de calcio se desarrollen con normalidad (González y cols., 1997). También recientemente se han demostrado en este modelo por vez primera que los depósitos de calcio actúan como túneles que transportan el calcio desde la parte basal de la célula hasta depósitos situados en el polo opuesto, con lo que se conseguiría que esos depósitos se rellenasen sin que fuese necesario un aumento a lo largo de toda la célula (Mogami y cols, 1998). Sin embargo, todavía queda prácticamente todo por descubrir acerca del modo en que se regulan y organizan estos depósitos.
Como podemos deducir de todo lo anterior, para que se pueda desarrollar el amplio rango de señales de calcio descritas hasta la fecha, las células de nuestro organismo cuentan con un delicado y complejo conjunto de sistemas de transporte de calcio que modulan un auténtico lenguaje celular, rico en matices e implicaciones y todavía profundamente incomprendido en algunos aspectos. A fin de cuentas, después de casi un siglo de investigación, el mapa de señales descubierto por dos investigadores en el intestino de un perro todavía tiene fronteras donde, como los antiguos cartógrafos, tenemos que poner la inscripción "más allá hay dragones".
